原因：

胰酶過度分解細胞表面黏附蛋白，細胞當場不會破碎，但會喪失貼壁能力，培養(yǎng)幾小時后大量漂浮死亡。

典型表現(xiàn)：

傳代完成時細胞形態(tài)完整、狀態(tài)無明顯異常，但是培養(yǎng)過夜后，細胞會呈現(xiàn)出整片漂浮、透亮虛化、無貼壁細胞。

解決辦法：

1、摒棄固定時間消化法，觀察鏡下狀態(tài)判斷：

常規(guī)貼壁細胞消化1分鐘后開始觀察，看到細胞皺縮變圓、間隙變大、輕晃瓶底有細胞松動，立即加入專用培養(yǎng)基終止消化，絕不硬卡3分鐘時長。

2、控制消化環(huán)境：

胰酶要提前拿出來，禁止使用4℃冷胰酶直接消化；加了胰酶的細胞要放37℃的培養(yǎng)箱消化，全程實時觀察，避免長時間放置。

3、定期更換胰酶：

胰酶反復開蓋、長期存放會導致活性不穩(wěn)定，建議小規(guī)格分裝，避光保存，建議每月更換新鮮胰酶，降低消化異常風險。

原因：

舊培養(yǎng)基中的血清，會中和胰酶活性，殘留的培養(yǎng)基，會導致細胞局部消化不全，操作人員為保證細胞充分脫落，通常會延長消化時間，進而導致整瓶細胞消化過度、細胞膜受損。

典型表現(xiàn)：

細胞脫落程度不均，部分細胞難以吹打脫落，部分細胞提前脫落；傳代后細胞大小不一，后續(xù)出現(xiàn)大量細胞漂浮、死亡。

解決辦法：

1、吸凈舊培養(yǎng)基后，須用無菌PBS輕柔漂洗1次，全覆蓋瓶底后輕輕晃動，全部沖掉殘留的血清與死細胞，再吸凈PBS，無殘留液體。

2、傳代操作中切勿省略 PBS 漂洗步驟。

原因：

快速、反復、大力吹打會產生大量氣泡，氣泡剪切力會撕裂細胞膜、破壞細胞骨架，造成細胞隱性損傷并喪失貼壁增殖的能力，后續(xù)會逐漸懸浮死亡。

典型表現(xiàn)：

傳代后1-6小時開始陸續(xù)漂細胞，細胞碎片多、狀態(tài)雜亂。

解決辦法：

1、規(guī)范吹打手法：

采用慢速、輕柔、無氣泡吹打方式，槍頭貼瓶壁緩慢出液，避免直沖細胞沉淀。

2、控制吹打次數(shù)：

每次傳代吹打5-8次即可，混勻細胞，禁止反復無休止吹打。優(yōu)先使用1mL槍頭吹打，避免使用5mL大槍頭，因力度過大而損傷細胞。

原因：

多數(shù)貼壁細胞存在密度依賴性生長，密度過低無法分泌生長因子，細胞自發(fā)凋亡；密度過高則細胞堆疊老化、營養(yǎng)匱乏，傳代后會批量死亡。

典型表現(xiàn)：

過稀：接種細胞零星分散，次日全部漂浮，無存活貼壁細胞；

過密：細胞長滿100%堆疊后傳代，細胞形態(tài)會干癟、破碎，存活率極低。

解決辦法：

1、嚴格把控傳代時機：

細胞匯合度80%-90%為最佳傳代狀態(tài)，禁止長滿100%堆疊后再傳代。

2、新手統(tǒng)一安全傳代比例：

常規(guī)細胞默認1:2傳代，絕不1:3、1:4及以上超稀疏傳代。

小眾難養(yǎng)的細胞、脆弱的細胞，則需要采用1:1的比例傳代，以保證細胞的密度。

原因：

剛復蘇的細胞會有殘留的DMSO毒性、存在大量隱性受損細胞，若細胞尚未恢復穩(wěn)定狀態(tài)就進行傳代，會引發(fā)細胞應激，出現(xiàn)大批量漂浮、死亡。

典型表現(xiàn)：

細胞復蘇后貼壁率低，存活細胞長滿后傳代正常。

解決辦法：

嚴格遵守復蘇流程：

1、細胞復蘇24小時后必須換液，全部清除殘留DMSO和死細胞。

2、禁止復蘇當天、復蘇24小時內傳代，等待細胞全貼壁、狀態(tài)穩(wěn)定后再操作。

六、隱性污染（支原體/微量細菌）

原因：

輕度支原體污染大多無肉眼可見渾濁、無明顯絮狀物，短期內不會造成細胞報廢，但會持續(xù)損傷細胞活性，導致每次傳代必漂、生長緩慢、形態(tài)畸形。

典型表現(xiàn)：

連續(xù)2次及以上傳代出現(xiàn)大量細胞漂浮，細胞黑點多、形態(tài)不規(guī)則、增殖速度大幅變慢。

解決辦法：

1、做支原體檢測，確認污染后直接丟棄污染細胞，切勿繼續(xù)傳代挽救。

2、全部消殺超凈臺、培養(yǎng)箱、水浴鍋，更換全新培養(yǎng)基、血清，避免交叉污染。

3、新復蘇細胞全程無菌規(guī)范操作，杜絕污染源。

原因：

培養(yǎng)基配比錯誤、血清變質、血清濃度不夠、批次差異，會直接導致細胞貼壁能力下降，傳代后大量漂浮死亡，未觀察到明顯污染，操作流程亦無異常，但細胞仍持續(xù)出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象。

典型表現(xiàn)：

操作流程標準、消化/吹打/密度全部正常，細胞依然一傳代就漂；細胞貼壁松散、形態(tài)干癟、伸展緩慢，生長速度持續(xù)偏慢。

解決辦法：

1. 嚴格把控血清濃度：

常規(guī)腫瘤細胞、普通貼壁細胞統(tǒng)一使用10%胎牛血清；脆弱細胞、原代細胞、難貼壁細胞需提升至12%-15%血清，嚴禁私自降至5%-8%低濃度，血清不足會直接導致粘附蛋白缺失、貼壁失敗。

2. 杜絕血清反復凍融：

原裝血清到貨后，按需分裝為50mL/100mL的小規(guī)格裝，-20℃避光保存，每次只用一管，禁止反復凍融；反復凍融會破壞血清生長因子、粘附蛋白，大幅降低細胞貼壁能力。

3. 禁止使用過期血清：

嚴禁使用過期、開封超過1個月、渾濁、輕微沉淀的血清。

4. 培養(yǎng)基規(guī)范使用：

專用培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，盡量1周內用完，最長不超過2周；放置過久的培養(yǎng)基會營養(yǎng)流失、pH失衡，導致細胞應激、貼壁脫落；禁止使用偏酸、偏堿、有輕微沉淀的老舊培養(yǎng)基。

5. 排查血清批次適配性：

部分細胞對血清批次敏感，更換新批次血清后出現(xiàn)持續(xù)漂細胞，大概率是血清批次不適配，需更換適配的批次血清。

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