做胰腺相關(guān)科研的小伙伴，大概率都被「小鼠胰腺星狀細(xì)胞（PSC）原代分離」難住過：明明跟著流程走，卻反復(fù)出現(xiàn)細(xì)胞活性低、爬出率不足、污染頻發(fā)，甚至全瓶細(xì)胞壞死的情況；耗費(fèi)了大量小鼠樣本、試劑和時(shí)間，卻連基礎(chǔ)的細(xì)胞鋪板都做不好，直接拖慢整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。

其實(shí)，小鼠胰腺星狀細(xì)胞原代分離的核心不在于“步驟齊全"，而在于“細(xì)節(jié)把控"——從試劑選型、儀器調(diào)試到每一步操作的力度、時(shí)長，哪怕一個(gè)小疏忽，都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)功虧一簣。今天，我們結(jié)合長期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，整理了一份專屬科研人的實(shí)用的分離培養(yǎng)指南，無冗余、無雷同，精準(zhǔn)破解分離難題，幫你一次搞定PSC原代分離！

一、實(shí)驗(yàn)前置準(zhǔn)備：細(xì)節(jié)拉滿，從源頭降低失敗率

小鼠胰腺星狀細(xì)胞原代分離的成功率，80%取決于前置準(zhǔn)備的細(xì)致度。不同于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，胰腺組織質(zhì)地脆弱、易污染，因此所有試劑、儀器、器材都需嚴(yán)格遵循“無菌、精準(zhǔn)、適配"原則，提前做好核對(duì)與處理。

（一）所需試劑（精準(zhǔn)適配小鼠胰腺星狀細(xì)胞，拒絕通用替代）

iCell原代星狀細(xì)胞培養(yǎng)體系：專為小鼠胰腺星狀細(xì)胞定制，含細(xì)胞生長所需的專屬營養(yǎng)因子，能顯著提升細(xì)胞貼壁率與活性，減少原代細(xì)胞分離過程中的損傷，相比普通培養(yǎng)基，可將實(shí)驗(yàn)失敗率降低60%以上；

緩沖液：無菌1×PBS（pH=7.2），用于胰腺組織清洗、細(xì)胞緩沖，pH值需嚴(yán)格校準(zhǔn)（偏差不超過±0.1），避免酸堿環(huán)境影響細(xì)胞活性，導(dǎo)致細(xì)胞難以爬出；

清洗液：無菌1×PBS（含5×雙抗P/S），雙重抑菌配方，可有效抑制細(xì)菌、真菌滋生，保護(hù)胰腺組織完整性，避免清洗過程中引入污染；

消化液：0.1%胰蛋白酶，溫和消化胰腺組織，既能打破組織間連接，又不會(huì)過度消化導(dǎo)致細(xì)胞破裂，大程度保留細(xì)胞活性；

75%無菌酒精：用于小鼠體表ce底除菌，殺滅毛發(fā)、皮膚表面的微生物，從源頭減少解剖過程中的污染隱患；

雙抗（P/S）：青霉素-鏈霉素混合液，輔助強(qiáng)化無菌環(huán)境，可按需加入清洗液、培養(yǎng)基中，進(jìn)一步降低污染風(fēng)險(xiǎn)；

0.1mg/ml多聚賴氨酸：用于包被T-25培養(yǎng)瓶，增強(qiáng)胰腺星狀細(xì)胞的貼壁能力，減少細(xì)胞脫落，為細(xì)胞快速鋪展生長提供支撐。

（二）所需儀器（提前調(diào)試，確保運(yùn)行穩(wěn)定）

超凈工作臺(tái)：實(shí)驗(yàn)核心無菌環(huán)境，使用前需紫外滅菌30min，通風(fēng)15min后再進(jìn)行操作，操作過程中避免打開工作臺(tái)玻璃門，防止雜菌進(jìn)入；

臺(tái)式離心機(jī)：用于后續(xù)細(xì)胞離心處理（本流程核心步驟暫未涉及，可提前調(diào)試至適宜轉(zhuǎn)速，做好備用，避免臨時(shí)調(diào)試影響實(shí)驗(yàn)節(jié)奏）；

電動(dòng)移液器：精準(zhǔn)控制試劑、組織塊吸取量，避免手動(dòng)操作的誤差，使用前需進(jìn)行高壓滅菌處理，確保無菌無雜質(zhì)；

熒光倒置顯微鏡：用于全程觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，重點(diǎn)監(jiān)測(cè)組織塊貼壁情況、細(xì)胞爬出進(jìn)度，便于及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)策略，避免錯(cuò)過好的處理時(shí)機(jī)。

（三）所需器材（無菌處理，杜絕污染漏洞）

移液管：分規(guī)格備用（適配不同試劑轉(zhuǎn)移需求），滅菌后密封保存，使用時(shí)避免觸碰非無菌區(qū)域，防止交叉污染；

15ml/50ml離心管：用于組織、細(xì)胞的離心處理，提前進(jìn)行高壓滅菌，確保管內(nèi)無殘留雜質(zhì)、無破損，避免離心過程中漏液污染；

眼科剪、眼科鑷：用于小鼠腹腔解剖、胰腺組織分離及修剪，需選用精細(xì)無菌款，避免刃口粗糙損傷胰腺組織，影響細(xì)胞活性；

80目不銹鋼網(wǎng)篩：用于過濾胰腺組織碎片，獲得純凈的組織塊（可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活選用，過濾后及時(shí)清洗滅菌，便于重復(fù)使用）；

10cm培養(yǎng)皿：用于胰腺組織的清洗、修剪、剪碎，提前加入少量清洗液，保持組織濕潤，避免組織失水壞死。

二、分步實(shí)操流程：精準(zhǔn)拆解，每一步都有避坑技巧

本流程專為4-8周齡健康小鼠設(shè)計(jì)，操作核心圍繞“無菌、輕柔、精準(zhǔn)"，全程規(guī)避科研人常踩的雷區(qū)，新手也能輕松上手，確保分離出的小鼠胰腺星狀細(xì)胞純度高、活性好。

1. 小鼠處死與體表除菌：選取4-8周齡健康小鼠（體重均勻，無疾病、無感染，優(yōu)先選用SPF級(jí)小鼠），采用頸椎脫臼法快速處死，避免小鼠長時(shí)間掙扎導(dǎo)致組織損傷；立即將小鼠放入75%無菌酒精中浸泡3-5min，期間輕輕晃動(dòng)小鼠，確保體表所有部位都能接觸酒精，ce底殺滅體表微生物。

【避坑提醒：酒精浸泡時(shí)間不可過長（超過5min），否則會(huì)損傷小鼠體表組織，間接破壞胰腺活性，導(dǎo)致后續(xù)細(xì)胞爬出率下降】

2. 胰腺組織分離：酒精浸泡完成后，迅速將小鼠轉(zhuǎn)入無菌超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無菌眼科剪沿腹中線輕輕剪開腹腔，用眼科鑷緩慢撥開腸道，找到暗紅色、不規(guī)則形的脾臟；輕輕翻開脾臟，其下方即可看到淡黃色、質(zhì)地柔軟、呈分葉狀的胰腺組織；用眼科鑷輕輕固定胰腺，配合眼科剪緩慢剪下，立即放入預(yù)先裝有含1×P/S的PBS清洗液的10cm培養(yǎng)皿中浸泡，防止組織干燥、失水壞死。

【避坑提醒：解剖動(dòng)作務(wù)必輕柔，避免戳破腸道、肝臟等器官，防止腸道內(nèi)容物、血液等雜質(zhì)污染胰腺組織，影響分離純度】

3. 胰腺組織修剪：收集多只小鼠的胰腺組織（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，確保獲得足夠體積的純凈組織），在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無菌眼科鑷固定胰腺，配合無菌眼科剪，仔細(xì)修剪去除胰腺表面的被膜、較大的胰腺導(dǎo)管及附著的血管、脂肪組織，盡量保留純凈的胰腺實(shí)質(zhì)組織。

【避坑提醒：修剪時(shí)力度要輕，避免過度擠壓、剪切胰腺實(shí)質(zhì)，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞活性；雜質(zhì)務(wù)必修剪干凈，殘留雜質(zhì)會(huì)增加污染風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)影響后續(xù)細(xì)胞分離純度】

4. 組織塊剪碎處理：將修剪干凈的胰腺組織轉(zhuǎn)入另一個(gè)無菌10cm培養(yǎng)皿中，加入少量無菌1×PBS緩沖液保持組織濕潤，用無菌眼科剪將胰腺剪成1mm×1mm×1mm大小的均勻組織塊，剪碎過程中可多次用PBS沖洗，去除組織碎屑。

【避坑提醒：組織塊大小需均勻一致，不可過大（細(xì)胞難以爬出）或過小（易破裂失活）；剪碎時(shí)避免產(chǎn)生過多組織碎屑，碎屑會(huì)影響后續(xù)組織塊貼壁】

5. 組織塊貼壁培養(yǎng)：提前用0.1mg/ml的多聚賴氨酸對(duì)T-25培養(yǎng)瓶進(jìn)行包被處理，包被后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)晾干備用（包被不ce底會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞貼壁不牢、易脫落）；用20μl無菌電動(dòng)移液器吸取剪好的胰腺組織塊，均勻鋪展在包被好的T-25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面，暫不添加培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置貼壁2h，讓組織塊充分吸附在培養(yǎng)瓶表面。

【避坑提醒：組織塊鋪展需均勻，避免堆積；靜置期間不可移動(dòng)培養(yǎng)瓶，防止組織塊脫落，影響貼壁效果】

6. 培養(yǎng)基添加與繼續(xù)培養(yǎng)：靜置2h后，取出培養(yǎng)瓶，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，先向培養(yǎng)瓶的非培養(yǎng)平面?zhèn)染徛尤?ml iCell原代星狀細(xì)胞wan全培養(yǎng)基，避免直接沖擊貼壁的組織塊（防止組織塊脫落、細(xì)胞損傷）；隨后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基均勻漫過培養(yǎng)平面上的組織塊，確保每塊組織都能充分接觸培養(yǎng)基，再將培養(yǎng)瓶放回37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

【避坑提醒：培養(yǎng)基添加需緩慢，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶時(shí)動(dòng)作輕柔，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)影響細(xì)胞貼壁和生長】

7. 細(xì)胞生長觀察：培養(yǎng)1-2天后，通過熒光倒置顯微鏡觀察，可見組織塊周圍有少量胰腺星狀細(xì)胞爬出（呈梭形、形態(tài)規(guī)則，無異常形態(tài)）；培養(yǎng)4-5天后，組織塊周圍會(huì)有大量細(xì)胞鋪展生長，細(xì)胞形態(tài)均勻、活性良好，此時(shí)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞換液、傳代或相關(guān)檢測(cè)操作。

【避坑提醒：培養(yǎng)期間需每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、有雜菌（如白色沉淀、渾濁發(fā)黃），需及時(shí)更換培養(yǎng)基，避免污染擴(kuò)散，導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗】

三、核心避坑總結(jié)：這些錯(cuò)誤千萬別犯！

很多科研人實(shí)驗(yàn)失敗，并非流程不對(duì)，而是忽略了這些關(guān)鍵細(xì)節(jié)，整理了以下高頻踩雷點(diǎn)，幫你避開所有彎路：

無菌操作不到位：這是常見的失敗原因！所有試劑、儀器、器材必須嚴(yán)格滅菌，超凈工作臺(tái)需提前消毒，實(shí)驗(yàn)人員需穿戴無菌手套、口罩、實(shí)驗(yàn)服，避免人為污染；

組織處理過于粗暴：胰腺組織質(zhì)地脆弱，解剖、修剪、剪碎過程中動(dòng)作過重，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，直接影響細(xì)胞活性和爬出率；

試劑配比/參數(shù)偏差：PBS緩沖液pH值、多聚賴氨酸濃度、胰蛋白酶濃度需嚴(yán)格按照要求配制，偏差會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞活性下降、貼壁失??；

觀察不及時(shí)：培養(yǎng)期間未及時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)，錯(cuò)過污染、組織塊脫落等問題好的處理時(shí)機(jī)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)功虧一簣；

樣本選擇不當(dāng)：選用年老、體弱或患病的小鼠，其胰腺組織活性差，分離難度大，大概率會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，優(yōu)先選用4-8周齡健康小鼠。

四、科研助力：專屬咨詢，幫你搞定所有難題

小鼠胰腺星狀細(xì)胞原代分離，看似簡(jiǎn)單，實(shí)則每一個(gè)細(xì)節(jié)都關(guān)乎實(shí)驗(yàn)成敗。如果你在實(shí)操中遇到「細(xì)胞爬出少、污染反復(fù)、活性不足」等問題，或是需要定制化實(shí)驗(yàn)方案、試劑選型建議，無需自行摸索，直接私信我們咨詢！

后續(xù)我們還會(huì)持續(xù)更新各類細(xì)胞原代分離、培養(yǎng)實(shí)操干貨，涵蓋不同細(xì)胞類型、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景，更有專業(yè)技術(shù)人員一對(duì)一答疑，拒絕雷同、拒絕冗余，記得持續(xù)關(guān)注，解鎖更多科研小技巧，幫你快速解決實(shí)驗(yàn)難題，節(jié)省時(shí)間和樣本成本，助力科研高效推進(jìn)！讓你的實(shí)驗(yàn)少走彎路、事半功倍～